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      教您如何正確冷凍保存ATCC細胞

      時間:2020-02-11 點擊次數:1034
         教您如何正確冷凍保存ATCC細胞
        一、ATCC細胞冷凍保存
        1、材料:
        生長良好之培養細胞、新鮮培養基、DMSO(Sigma D-2650)、無菌塑料冷凍保存管(Nalgene 5000-0020)、0.4%(w/v)trypan blue(GibcoBRL15250-061)、血球計數盤與蓋玻片、等速降溫機(KRYO10SeriesII)。
        2、冷凍保存方法:
       ?。?)傳統方法:冷存管置于4℃10分鐘→ -20℃30分鐘→ -80℃16~18小時(或隔夜)→液氮槽vaporphase長期儲存。-20℃不可超過1小時,以防止冰晶過大,造成細胞大量死亡,亦可跳過此步驟直接放入-80℃冰箱中,惟存活率稍微降低一些。
       ?。?)ATCC細胞程序降溫:利用已設定程序的等速降溫機以-1~-3℃/分鐘之速度由室溫降至(-80℃以下)-120℃,再放在液氮槽vaporphase長期儲存。適用于懸浮型細胞與hybridoma之保存。
        3、步驟:
       ?。?)冷凍前一日前更換半量或全量培養基,觀察細胞生長情形。
       ?。?)配制冷凍保存溶液(使用前配制):將DMSO加入新鮮培養基中,zui后濃度為5~10%,混合均勻,置于室溫下待用。
       ?。?)依細胞繼代培養之操作,收集培養之細胞,取少量細胞懸浮液(約0.1ml)計數細胞濃度及凍前存活率。
       ?。?)離心,去除上清液,加入適量冷凍保存溶液,使細胞濃度為1~5×106cells/ml,混合均勻,分裝于已標示*之冷凍保存管中,1ml/vial,并取少量細胞懸浮液作污染檢測。
        4、注意事項:
       ?。?)欲冷凍保存之細胞應在生長良好(logphase)且ATCC細胞存活率高之狀態,約為80–90%致密度。
       ?。?)冷凍前檢測細胞是否仍保有其*性質,例如hybridoma應在冷凍保存前一至二日測試是否有抗體之產生。
       ?。?)注意冷凍保護劑之品質。DMSO應為試劑級等級,無菌且無色(以0.22micron FGLP flon過濾或是直接購買無菌產品,如Sigma D-2650),以5~10ml小體積分裝,4℃避光保存,勿作多次解凍。Glycerol亦應為試劑級等級,以高壓蒸汽滅菌后避光保存。在開啟后一年內使用,因長期儲存后對細胞會有毒性。
       ?。?)冷凍保存之細胞濃度:
       ?、賜ormal human fibroblast:1~3×106cells/ml
       ?、趆ybridoma:1~3×106cells/ml,細胞濃度不要太高,某些hybridoma會因冷凍濃度太高而在解凍24小時后si去。
       ?、踑dherent tumor lines:5~7×106,依細胞種類而異。Adenocarcinoma解凍后須較高之濃度,而HeLa只需1~3×106cells/ml
       ?、躱ther suspensions:5~10×106cells/ml,human lymphocyte須至少5×106cells/ml。
       ?。?)ATCC細胞冷凍保護劑濃度為5或10%DMSO,若是不確定細胞之冷凍條件,在做冷凍保存之同時,亦應作一個backup culture,以防止冷凍失敗。
        二、冷凍細胞活化
        1、冷凍細胞之活化原則為快速解凍,以避免冰晶重新結晶而對細胞造成傷害,導致細胞之死亡。
        2、細胞活化后,約需數日,或繼代一至二代,其細胞生長或特性表現才會恢復正常(例如產生單株抗體或是其它蛋白質)。
        3、材料 :37℃恒溫水槽、新鮮培養基、無菌吸管/離心管/培養瓶、液氮或干冰容器 。
        4、步驟:
       ?。?)操作人員應戴防護面罩及手套,防止ATCC細胞冷凍管可能爆裂之傷害。
       ?。?)自液氮或干冰容器中取出冷凍管,檢查蓋子是否旋緊,由于熱脹冷縮過程,此時蓋子易松掉。
       ?。?)將新鮮培養基置于37℃水槽中回溫,回溫后噴以70%酒精并擦拭之,移入無菌操作臺內。
       ?。?)取出冷凍管,立即放入37℃水槽中快速解凍,輕搖冷凍管使其在1分鐘內全部融化,以70%酒精擦拭保存管外部,移入無菌操作臺內。
       ?。?)取出解凍之細胞懸浮液,緩緩加入有培養基之培養容器內(稀釋比例為1:10~1:15),混合均勻,放入CO2培養箱培養。取0.1ml解凍細胞懸浮液作存活測試。
       ?。?)解凍后是否立即去除冷凍保護劑(例如DMSO或glycerol),依細胞種類而異,一般而言,大都不需要立即去除冷凍保護劑。惟若要立即去除,則將解凍之細胞懸浮液加入含有5-10ml培養基之離心管內,離心1000rpm,5分鐘,移去上清液,加入新鮮培養基,混合均勻,放入CO2培養箱培養。
       ?。?)ATCC細胞若不需立即去除冷凍保存劑,則在解凍培養后隔日更換培養基。

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