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      這十年來廣受關注公共衛生問題

      時間:2023-06-28 點擊次數:334

      高致病性冠狀病毒感染成了這十年來廣受關注公共衛生問題。嚴重急性呼吸綜合征(SARS,2002-2004),中東呼吸綜合征(MERs,2012-至今),每一個對人類健康,經濟發展都帶了巨大的沖擊。
      病毒通過接觸,飛沫,氣溶膠等形式,引起廣泛傳播,引起高感染率。雖然SARS和MERS初表現為輕微的流感樣疾病,并伴有發燒、呼吸困難和咳嗽,但進展到更嚴重的癥狀是非典型間質性肺炎和彌漫性肺泡損傷。他們都能引起急性呼吸窘迫綜合征(ARDS),這是急性肺損傷中嚴重的一種,50%的ARDS患者肺泡炎、肺炎和缺氧導致呼吸衰竭、多器官疾病和死亡。
      COV特別令人關切的是,病例死亡率高,缺乏經驗證的治療藥物,以及這些病原體迅速跨越地理和地緣政治邊界進入其他國家和大陸的種子爆發能力。




      冠狀病毒科

      高致病性冠狀病毒SARS-CoV和MERS-CoV近出現在人類群體中,但包括HCoV-oc43、HCoV-229e、HCoV-nl63和HCoV-hku1在內的其他人類冠狀病毒估計已在人類群體中傳播了數百年,導致輕度呼吸道疾病,其中約5-30%的“普通感冒"。

      在冠狀病毒科(nidovirales)中,有四個屬被鑒定:alphacoronavirus,betacoronavirus,gammacoronavirus和deltacoronavirus 。
      目前鑒定的幾種人HCoVs屬于alphacoronavirus(HCoV-229e和HCoV-nl63)和betacoronavirus(SARS-cov、MERS-cov、HCoV-OC43和HCoV-HKU1)。gammacoronavirus和deltacoronavirus沒有已知感染人類的病毒。



      冠狀病毒感染成了這十年來廣受關注公共衛生問題

      反向遺傳學系統

      高致病性冠狀病毒和潛在泛冠狀病*物候選藥物的研究進展,部分依賴于基因操縱CoVS的技術,以探討病毒發病機制和抗病*物活性。

      反向遺傳學系統可根據已知的病毒序列合成病毒。因為傳染性病人樣本收取、分離、運送等限制了大多數實驗室對臨床分離病毒的獲取和使用。反向遺傳學系統為研究病毒的發病機制和模型開發提供了必要的研究材料。

      在SARS大流行之前,通過系統地將cDNA盒組裝成全長的傳染性克隆,可以對病毒基因進行精確和有針對性的遺傳操作,已經開發出了強大的反向遺傳學系統來操縱CoVs的基因組。

      感染性克隆允許創造近同質的病毒種群,而傳統的病毒種群是通過放大細胞培養來制備的。除了重建covs的流行株外,反向遺傳系統還允許將突變靶向到特定的病毒基因,獲取無傳染性的組裝病毒 。

      作為一個例子,將分離特定基因突變的能力應用于SARS-CoV的Spike(S)糖蛋白的研究,同時保持病毒復制體和其他結構蛋白的等基因背景。將SARS-CoV暴發的人畜共患病、早期、中期和晚期流行病毒株的突變插入SARS-CoV(Urbani)流行菌株的s糖蛋白中,以確定進化對病毒進入人類細胞的影響,以及嚙齒動物和靈長類疾病模型中病毒的發病機制。通過將突變靶向到特定的病毒基因,反向遺傳學系統允許研究人員探索宿主對病毒遺傳變化的致病反應的因果關系。此外,利用反向遺傳學技術合成大量研究用材料,對于高通量藥物篩選研究極為重要。

      細胞研究系統

      和所有其他病毒一樣,冠狀病毒需要宿主細胞機制來復制它們的基因組,產生后代病毒,并導致疾病 。
      細胞株需要宿主細胞受體的表達以及必要的蛋白酶的表達,以促進病毒的進入。

      冠狀病毒的S糖蛋白是宿主細胞附著和病毒進入的主要決定因素,在HCoVs之間不太保守 。雖然所有已知的HCoVS都有針對人類呼吸道的病毒性取向,但還沒有建立可被廣泛HCOVS感染的肺細胞系。

      SARS-CoV和MERS-CoV的一個關鍵特征是,高致病性冠狀病毒在更廣泛的細胞系中比其他輕度致病性冠狀病毒HCoV-OC43、HCoV-229e、HCoV-nl63和HCoV-hku1的病毒滴度更高。

      用HCoVs和BatCoVs感染各種動物的細胞系,有助于發現病原體的潛在宿主范圍,并有助于識別參與病毒傳播的易感哺乳動物宿主。但也不是對應關系,在動物體內,受體及免疫的多樣性和可用性與單純細胞系不同。原代細胞進行假復層氣道上皮培養,可以模擬動物體內氣道上皮細胞的復雜性,但是無法捕捉到,完整免疫系統與病毒相互作用,包括促炎細胞的浸潤,這些細胞可能在嚴重形式的SARS和MERS中促進ARDS。類器官可能模擬免疫細胞和病毒的相互作用,但還沒有在冠狀病毒應用。

      泛冠狀病毒體內研究模型

      小動物模型

      在2003年SARS-CoV出現后,通過給動物接種病人分離SARS-CoV,啟動了小動物模型的開發,包括:小鼠、倉鼠、豚鼠和雪貂,但只有雪貂表現出感染引起的疾病跡象。

      在小鼠的實驗中,小鼠可以復制SARS-Cov,但沒有引起疾病跡象,在這些模型中,病毒從肺中迅速清除。

      多個研究小組發現在小鼠肺部連續傳代,產生小鼠適應性SARS-cov,在野生型小鼠鼻內感染模型中引起致死性肺部疾病,此模型被用于藥物開發。野生型自交系小鼠的SARS-CoV適應模型的益處包括通過個體小鼠的存活、體重減輕和全身多層攝影檢測的可復制的疾病易感性,以及浸潤細胞的定量、病毒滴度、組織病理學、轉錄和蛋白質組學在靶器官中的變化。

      為了評估體內緊急病毒的發病機制,人畜共患SARS-cov和preemergent batcov突變已被納入SARS-CoV MA15模型,為有可能出現在人類體內的病毒提供了新的動物模型。在SARS-CoV MA15模型中,研究嚴重Cov疾病的變量,其他有價值的因素包括年齡、劑量和宿主對疾病表型的遺傳貢獻。

      用于藥物發現的SARS-cov小鼠適應模型的大局限性是將突變納入SARS-cov基因組(特別是用于測試針對具有突變的病毒基因的抗病*物),以及小鼠和人類免疫反應之間的差異。

      與SARS-CoV不同的是,MERS-CoV的人類臨床病毒株沒有在小鼠、倉鼠或雪貂中復制,原因是:人類DDP4與實驗動物的關鍵氨基酸存在差異。在兔子模型中發現病毒復制,但是沒有臨床表現,所以少量藥物研究在使用。人DDP4轉基因小鼠開始被使用,類似于SARS-CoV,在小鼠肺傳代產生適應性,進而產生臨床表現。CRISPR/Cas9也被用于產生特定基因突變DDP4的轉基因鼠。

      靈長類動物

      小動物模型作為冠狀病毒感染的模型得到了更*的開發,這是由于嚙齒動物容易被操縱,以及與非人類靈長類動物(NHPS)相關的成本和倫理問題增加所致。然而,高致病性冠狀病毒感染的NHP模型的發展是評價泛冠狀病毒治療學的關鍵,因為來自NHPS的宿主免疫反應與人類相比具有更大的同源性,并且可能更準確地指示評估泛冠狀病毒治療所需的嚴重疾病的免疫生物標志物。

      在NHP感染模型中觀察到疾病表征與嚙齒類動物SARS-CoV和MERS-CoV模型不同。從人類中分離出的SARS-COV和MERS-CoV都在NHPS中復制,可以體現對冠狀病毒引起的疾病的重要方面的保護,包括呼吸道生物學、受體同源性以及宿主受體和蛋白酶的表達模式。

      常見的SARS-CoV實驗室靈長類動物,包括非洲綠猴、恒河猴、獼猴和常見的狨猴,導致了不同程度的嚴重程度的疾病跡象,但沒有一種能反映人類所見的致死性SARS疾病,感染后急性肺組織病理學觀察到嚴重的疾病表型(3-6天),典型表現為肺部病變和肺炎,偶爾觀察到彌漫性肺泡損傷??梢詮椭撇糠掷夏昙又氐谋硇秃吞烊幻庖弋惓W兓?。

      非人類靈長類動物MERS-CoV感染模型,其中*特征的模型為恒河猴和普通狨猴的MERS-CoV感染。注射MERS-CoV病毒,引起輕癥改變,很少見可觀察的疾病變化。包括注射,口服等多種形式給病毒可以引起中等程度的改變,重癥模型在狨猴可見。但是多種途徑,就無法體現病毒實際感染路徑。同時缺乏可重復的臨床疾病體征,如發燒、呼吸窘迫或致命性。

      泛抗冠狀病*物

      三類靶點

      1. 非結構型蛋白:3c樣蛋白酶(3CLpro)、木瓜蛋白酶(PLpro)和RNA依賴性RNA聚合酶(RdRp)。

      2. 結構性蛋白:Spike(S)糖蛋白、包膜(E)蛋白、膜(M)蛋白和核帽(N)蛋白

      3. 輔助蛋白:病毒間變異太大,不是很好的藥物靶點


      靶向CoV非結構性蛋白(nonstructural proteins,nsps)

      冠狀病毒NSPs是冠狀病毒生命周期中高度保守的成分,介導病毒復制,包括3c樣蛋白酶(3CLpro)、木瓜蛋白酶(PLpro)和RNA依賴性RNA聚合酶(RdRp)。

      CoVRdRp復制病毒RNA基因組并生成病毒RNA轉錄本,這是細胞聚合酶無法實現的基本功能。CoV生命周期的另一個基本元素是由3CLpro和PLpro兩種病毒蛋白酶將病毒多蛋白水解成功能性的nsps。

      除了聚合酶和蛋白酶功能外,CoVs的nsps還具有其他基本功能,包括免疫拮抗、雙膜囊泡組織、復制復合物、核酸結合、解旋酶活性和病毒RNA校對,這些功能可能是冠狀病毒特異性抗病*物發現的未來靶點。

      GS-5734瑞德西韋(Remdesivir

      GS-5734是一種小分子核苷類似物,靶向病毒RdRp(RNA合成酶),起到抑制病毒復制作用在體外對幾個新出現的傳染病的病毒家族表現出抗病毒活性,包括絲狀病毒科、肺炎病毒科、副粘病毒科和冠狀病毒科。

      三個臨床包括兩個:
      NCT02818582( GS-5734 to Assess the Antiviral Activity, Longer-Term Clearance of Ebola Virus, and Safety in Male Ebola Survivors With Evidence of Ebola Virus Persistence in Semen,National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID)
      NCT04257656 (Severe  Remdesivir RCT,Capital Medical University ,Bin Cao, China-Japan Friendship Hospital
      NCT04252664(Mild/Moderate  Remdesivir RCT,Capital Medical University,Chinese Academy of Medical Sciences,Bin Cao, China-Japan Friendship Hospital

      洛匹那韋-利托那韋((克力芝)

      洛匹那韋-利托那韋初是作為HIV-1蛋白酶抑制劑開發的,但在體外活性也針對SARS-CoV非結構蛋白3CLpro。在SARS-CoV流行期間,SARS患者的洛匹那韋-利托那韋聯合利巴韋林治療與歷史對照病例相比,降低了病毒載量,降低了死亡或ARDS的不良臨床結果。

      在MERS出現后不久,已知抗病毒化合物的高通量篩選方法在體外鑒定了洛匹那韋對MERS-cov的活性,口服洛匹那韋-利托那韋治療MERS-CoV狨猴模型,MERS疾病體征略有改善,包括胸部x線識別的肺浸潤減少,間質性肺炎減少,體重減輕。病人治療有陽性結果,包括退燒,血清和痰的病毒清除,以及生存有關。根據體外和體內對抗MERS-cov的活性,沙特阿拉伯一項臨床,住院的MERS患者中使用洛匹那韋-利托那韋和IFN-β1b聯合治療。

      利巴韋林

      利巴韋林是一種鳥苷類似物,對大量高致死性新興病毒具有體外活性。利巴韋林抑制病毒RdRp,抑制RNA合成,并抑制mRNA的Capping。然而,研究表明,雖然SARS-CoV、MERS-CoV和HCoV-oc43在體外對利巴韋林敏感,但顯著抑制CoV復制的劑量,超過了人類使用利巴韋林(濃度。

      在小鼠模型中對利巴韋林的體內測試發現,單獨使用利巴韋林對MA15SARS-CoV的活性有限,并顯示利巴韋林治療可增強SARS疾病征象。

      然而,利巴韋林和I型干擾素在靈長類動物模型中的聯合治療改善了MERS的疾病體征。病人治療,利巴韋林治療高致病性冠狀病毒呼吸綜合征患者的療效有限。

      靶向cov結構蛋白和輔助蛋白

      結構蛋白:Spike(S)糖蛋白、包膜(E)蛋白、膜(M)蛋白和核帽(N)蛋白。

      S蛋白決定病毒細胞取向、宿主范圍和病毒進入;E蛋白促進病毒的組裝和釋放,并具毒素活性;M蛋白維持病毒子膜結構;N蛋白使病毒RNA基因組化。但是研究顯示部分結構蛋白去除,并不改變病毒復制能力。

      輔助蛋白因為數量,序列,功能在病毒間差異非常大,不是很好的藥物靶點。

      單抗藥物

      針對S蛋白的單抗藥物研究多,以期阻止病毒進入宿主細胞。但是病毒會通過突變,躲避抗體藥物。所以有設計單抗藥物雞尾酒以克服病毒的逃逸。也有報道,S蛋白抗體會激活病毒。

      疫苗

      疫苗長期以來一直被認為是針對人類群體的預防和*傳染病的金標準,并賦予個人長期免疫保護的好處。但是冠狀病毒是人畜共患病,針對人的疫苗也無法*。針對中間宿主的疫苗也在開發,針對MERS-COV的駱駝中間宿主的疫苗接種策略已經開發出來,這可能有助于抑制駱駝中的病毒復制,防止MERS-COV傳播到人類,針對sars-cov開發的疫苗制劑不僅未能保護老年人群的動物模型,而且還導致年輕人群的免疫病理。所以疫苗開發有很多路要走。

      靶向宿主

      宿主因素調節

      針對病毒蛋白的小分子化合物及抗體藥物,病毒可以突變自己,來適應,產生耐藥。因而,有研究想通過改變宿主細胞蛋白(尤其是和病毒生命周期密切相關的宿主蛋白),這樣可以避免病毒突變產生的耐藥。幾個研究組開始針對宿主蛋白酶(弗林蛋白酶,組織蛋白酶,跨膜絲氨酸蛋白酶,這些蛋白酶是病毒通過S蛋白進入宿主所需)抑制劑。但是不同病毒通過S蛋白進入宿主細胞所需蛋白酶有差異。環孢菌素開始進入研究,展現一定效果。

      宿主免疫調節

      合理的利用免疫系統,肯定是抗病毒的*出路。比如1型IFN被用于冠狀病毒臨床治療。因為1型干擾素是連接天然和適應性免疫的重要橋梁。當然在細胞因子風暴出現后,抑制免疫也成為對癥治療必需做出的選擇。如何使用宿主免疫調節,也是關鍵。



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